Окраска ГЭ — это обязательный этап для любого гистологического исследования. По препаратам, окрашенным этим методом, можно поставить большинство гистологических диагнозов, увидеть основные структуры и составляющие исследуемого объекта.

Прежде чем окрасить препарат, нужно сначала высушить его и обезводить.

Высушивание стекла с парафиновым срезом

Оптимальные методы:

— выловить срез на стекло и оставить при комнатной температуре до утра

— вертикально высушить срез на стекле в термостате 60оС в
течение 1 часа

— поместить для сушки в нагревательный отсек стейнера

Другие методы:

— поместить срез в водяную баню, выловить на стекло и
подогреть над пламенем спиртовки (или феном)

— горизонтально подогреть на нагревательном столике.

После того, как срез высушен, можно приступить к окраске.

Общие этапы для удаления парафина перед окраской. Депарафинирование

  1. Ксилол (или его заменитель) 3 смены по 3 минуты
  2. Этанол (или изопропанол) 3 смены по 1-2 минуты
  3. Дистиллированная или деионизированная вода 1-2 мин или
    дольше (сколько необходимо)
    Замена первых реактивов производится через каждые 60-80-
    100 стекол. Первые реактивы (ксилол и спирт) выливаются,
    следующие перемещаются на одну позицию влево. Последние
    — свежие.

Депарафинирование должно осуществляться при температуре не ниже 20оС, иначе парафин очень плохо удаляется из срезов и блокирует участки, подлежащие окрашиванию.

Окраска

Гематоксилин

Бывает 2 типов: прогрессивный, который не требует последующего
извлечения избытка красителя, и регрессивный, который красит избытком красителся с последующей его отмывкой.

Прогрессивный окрашивает от 3 и до 20 минут (в зависимости
от длительности использования и чистоты красителя).
Регрессивный до 10 сек и до 5 минут (можно дольше).

После каждого красителя применяют проточную воду 1-5-10
минут (выполняет роль подсинивающего буфера).
После регрессивного гематоксилина ставится проточная вода на 1 мин,
далее — дифференцирующие растворы (солянокислый спирт
0.25-1% на 70-96% этаноле или 0.25-0.5% водная соляная
кислота). Количество погружений стекол в раствор
устанавливается опытным путем с последующим контролем
под микроскопом. После — промывка в 2 сменах проточной
воды по 1 минуте в каждой, затем третья смена проточной
воды от 3 мин и более, до того, как все ядра клеток станут
синими.

Необходимо фильтровать любой гематоксилин после работы и доливать до уровня свежим.

Подсинивание можно выполнять с помощью подсинивающих
растворов.

Оптимальные:

— промывочный буфер для ИГХ (PBST или TBST)

— вода Скотта

— мраморная крошка в проточной воде.

Менее эффективные подсинивающие агенты — раствор аммиака или пары аммиака. При обработке этими реактивами срезы могут слезть со стёкол.

Далее стекла помещают в дистиллированную или
деоинзированную воду. Лучше сделать 2 смены по 2 минуты, чтобы
удалить остатки подсинивающих буферов — они извлекают
окраску эозином.

Окраска эозином возможна красителями, содержащими разный
процент эозина на основе спирта, воды или вода+спирт (оптимальный вариант).

Время окраски эозином от 10 сек до 3 мин. После стекла переносят в
дистиллированную воду для отмывки избытка эозина или в спирт, если используется спиртовой раствор красителя.

Избыток эозина можно отмыть опусканием стекла последовательно в
спирт-воду-спирт до тех пор, пока не будет достигнут
желаемый оттенок. При этом нужно помнить, что последующими
спиртами может быть извлечено еще какое-то количество
эозина. Длительность этапов отмывки определяется экспериментально и контролируется визуально под микроскопом.

Эозин, как и гематоксилин, необходимо ежедневно фильтровать, доливая до уровня свежим раствором.

Обезвоживание. После эозина идут 3-4 смены этанола или изопропанола по 2 мин каждая. Первая смена выливается через 60-8-100 стекол, или при помутнении. Остальные переставляются на одну позицию влево, так, чтобы последняя получилась свежая.

Просветление. Происходит посредством 2 смен ксилола по 1 минуте.
Карбол-ксилол совершенно лишний в этом процессе при
условии своевременной замены реактивов.

Протоколы окраски ГЭ

Ручной протокол

Ксилол 3 мин
Ксилол 3 мин
Ксилол 3 мин
Этанол (ИПА) 2 мин
Этанол (ИПА) 2 мин
Этанол (ИПА) 2 мин

Дистиллированная вода 2 мин

Гематоксилин 3-20 мин (в зависимости от типа)

Проточная вода 2 мин

Дифференцирующий раствор 10 сек — 1 мин (для регрессивного; время зависит от типа раствора)

Проточная вода 3-5 мин или
подсинивающий раствор
(можно дольше — до синих ядер)

Дистиллированная вода 2 смены по 2 мин

Эозин 10 сек — 3мин

Дистиллированная вода 1 минута или дольше

Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Этанол (ИПА) 3 мин
Ксилол 1 минута
Ксилол 1 минута (или дольше, если необходимо).

Общее время процесса: 44 мин — 60 мин.

Для окраски в стейнерах протокол может быть похожим, но не каждый стейнер имеет столько станций для реагентов. Иногда полностью соблюсти вышеописанный протокол не представляется возможным, поэтому приходится жертвовать этапами с дистиллированной водой и дифференцировкой, а также сокращать этапы с этанолом и ксилолом. В этом случае необходимо чаще менять ксилолы и спирты, а также красители, т.к. увеличивается их расход, что, кстати, влияет на себестоимость исследования.

Очень желательно на рабочем месте для окраски иметь работоспособный микроскоп с малым увеличением (10х).

Контролируйте вашу окраску перед подачей стекол патологам!

Меню