Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии

info@histotechnology.ru

anti-p63 — Антитела к белку p63 (ядерный маркер базальных и миоэпителиальных клеток)

I - Integrity - Целостность.

K - Knowledge - Знание.

O - Optimization - Оптимизация.

N - Necessity - Необходимость.

I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-p63

Антитела к белку p63 (фактор транскрипции семейства p53). Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-p63

Anti-p63 распознаёт две изоформы p63 — TAp63 и ΔNp63. Белок p63 — это белок с ядерной локализацией, являющийся фактором транскрипции. Ген p63 расположен на хромосоме 3q27–29, принадлежит к семейству генов p53 и кодирует 6 изоформ. p63 играет важную роль в росте и развитии многих эпителиальных органов и является главным регулятором пролиферации эпидермальных кератиноцитов и роста эмбрионального эпидермиса.

Белок p63 обычно экспрессируется в базальном слое или слое клеток-предшественников многослойного эпителия (плоского, уротелиального, бронхиального), в базальных клетках некоторых железистых эпителиев (например, предстательной железы), а также в миоэпителиальных клетках грудных, потовых и слюнных желёз, трофобластах и тимусе.

Anti-p63 является важным инструментом для дифференциальной диагностики между доброкачественными и злокачественными изменениями в предстательной железе, а также может использоваться для дифференцировки плоскоклеточного рака лёгких и аденокарциномы лёгких, плоскоклеточного рака шейки и аденокарциномы шейки матки, рака молочной железы in situ и инвазивной аденокарциномы молочной железы. Сочетание антитела p63 и высокомолекулярных цитокератинов повышает чувствительность обнаружения базальных клеток.

p63-позитивен плоскоклеточный рак любой локализации, уротелиальный рак; позитивна часть анапластических крупноклеточных лимфом, опухоли при мукоэпидермальном раке, аденокистозном раке, метапластической карциноме молочной железы, саркоматоидной карциноме и гигантоклеточных опухолях костей.

Ключевой принцип: anti-p63 применяется для подтверждения базального и миоэпителиального компонента и для дифференцировки плоскоклеточного и уротелиального рака; интерпретируется в связке с цитокератинами и другими линей-специфическими маркерами.

Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Ядро клеток

Оптимальный позитивный и негативный контроль

В качестве основного положительного тканевого контроля для p63 рекомендуется плацента, в которой должна наблюдаться реакция ядерного окрашивания диспергированных цитотрофобластов от слабой до умеренной. Цитотрофобласты должны быть видны даже при малом увеличении (объектив 5×). Дополнительным позитивным и одновременно отрицательным тканевым контролем может служить миндалина: практически все клетки плоского эпителия должны демонстрировать реакцию ядерного окрашивания от умеренной до сильной, тогда как диспергированные лимфоциты и эндотелиальные клетки — слабую, но отчётливую реакцию. Подавляющее большинство лимфоцитов должно оставаться негативным.

При невозможности использовать плаценту или миндалину в качестве контроля допустимо применять шейку матки (ядерное окрашивание базальных и парабазальных клеток), молочную железу и предстательную железу (миоэпителий протоков молочной и предстательной железы позитивный, эпителий протоков и стромальные элементы — отрицательные).

Плацента + миндалина — для рутинного исследования.
Плацента + миндалина + ацинарная аденокарцинома предстательной железы + гиперплазия предстательной железы, простатическая интраэпителиальная неоплазия — для валидации протокола.

Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:

Ацинарная аденокарцинома предстательной железы — опухолевые клетки негативны; ядерная реакция сохраняется только в рассеянных базальных клетках при их наличии.
Гиперплазия предстательной железы и ПИН — позитивное ядерное окрашивание базальных клеток, люминальный эпителий негативен.
Миндалина — плоский эпителий демонстрирует умеренную или сильную ядерную реакцию, лимфоциты и эндотелий — слабую, но отчётливую ядерную реакцию.
Плацента — служит внутренним позитивным контролем: цитотрофобласты должны быть ядерно-позитивны от слабой до умеренной степени.

Примеры окрашивания

Каждое изображение можно заменить — для этого измените атрибут src у соответствующего тега <img>.

Миндалина, окраска гематоксилином и эозином

Миндалина, H&E. Покровный многослойный плоский эпителий и лимфоидные фолликулы со светлыми центрами. Препарат окрашен оптимально: типичный диапазон окрашивания ядер, мелкие лимфоциты с конденсированным хроматином, более крупные лимфоидные клетки — со светлым хроматином, чёткими ядерными мембранами и эозинофильными ядрышками.

Плацента, окраска гематоксилином и эозином

Плацента, H&E. Ворсинчатое дерево с наличием цитотрофобласта. Препарат окрашен оптимально: признаки неравномерного окрашивания, недостаточной фиксации и проводки отсутствуют, типичный диапазон окрашивания ядер.

Оптимальное окрашивание миндалины p63. В большинстве клеток плоского эпителия миндалины наблюдается интенсивное окрашивание ядер. В рассеянных лимфоцитах отмечается слабая, но отчётливая ядерная реакция. Фоновое окрашивание отсутствует.

Недостаточное окрашивание p63 в миндалине

Недостаточное окрашивание миндалины p63. Умеренная реакция ядерного окрашивания наблюдается в большинстве клеток плоского эпителия, тогда как в лимфоцитах окрашивание не выявляется. Протокол обладает пониженной чувствительностью к клеткам с низким уровнем экспрессии p63.

Оптимальное окрашивание плаценты p63. Рассеянные клетки цитотрофобласта демонстрируют слабую или умеренную реакцию окрашивания с чёткой ядерной локализацией. Фоновое окрашивание отсутствует.

Недостаточное окрашивание p63 в плаценте

Недостаточное окрашивание плаценты p63. Значительно уменьшено количество окрашенных цитотрофобластических клеток, окрашивание едва различимо. Протокол обладает пониженной чувствительностью к клеткам с низким уровнем экспрессии p63.

Параметр	Ventana (4A4)	Biocare Medical (4A4)
Клон	4A4	4A4
Производитель	Ventana	Biocare Medical
№ продукта / № лота	790-4509 / G10176	CM 163 A, B, C / 031720A
Формат	Ready-To-Use (prediluted)	Концентрат
Дилюэнт	Нет	Да
Дилюэнт: № продукта / № лота	—	Ventana / 251-018
Разведение	—	1:100
Время инкубации / температура	32 мин / 36 °C	32 мин / 36 °C

Параметр	Ventana (4A4)	Biocare Medical (4A4)
Прибор	On Board / On Machine	On Board / On Machine
Буфер	Ventana Ultra CC1	Ventana Ultra CC1
Время нагрева при макс. температуре	64 мин	64 мин
Максимальная температура нагрева	95 °C	95 °C

Параметр	Ventana (4A4)	Biocare Medical (4A4)
Производитель	Ventana	Ventana
Продукт / номер	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации линкера	8 мин	8 мин
Время инкубации полимера	8 мин	8 мин
Температура инкубации	20 °C	36 °C

Параметр	Ventana (4A4)	Biocare Medical (4A4)
Производитель	Ventana	Ventana
Продукт / номер	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура	4 мин / 20 °C	8 мин / 36 °C
Усилитель	CuSO₄	CuSO₄

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

Следующим шагом протестируйте первичное антитело в серии разведений, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить реагент и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

Уменьшите концентрацию первичных антител.
Сократите время инкубации первичных антител.
Сократите время инкубации вторичных антител.
Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

Уменьшите концентрацию первичных антител.
Сократите время инкубации первичных антител.
Сократите время инкубации вторичных антител.
Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.
Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

Увеличьте концентрацию первичных антител.
Увеличьте время инкубации первичного антитела.
Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
Усильте блокирование фонового окрашивания.
Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

Усильте блокирование фонового окрашивания.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Примечание

Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Юнусов Теймур Юнусович

Кандидат биологических наук, Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

Livasy CA, Karaca G, Nanda R, Tretiakova MS, Olopade OI, Moore DT, Perou CM. Phenotypic evaluation of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. Mod Pathol. 2005 Dec 2.
Ueo T, Kashima K, Daa T, Kondo Y, Sasaki A, Yokoyama S. Immunohistochemical analysis of morules in colonic neoplasms: morules are morphologically and qualitatively different from squamous metaplasia. Pathobiology. 2005;72(5):269–78.
Varma M, Jasani B. Diagnostic utility of immunohistochemistry in morphologically difficult prostate cancer: review of current literature. Histopathology. 2005 Jul;47(1):1–16.
Weinstein MH, Signoretti S, Loda M. Diagnostic utility of immunohistochemical staining for p63, a sensitive marker of prostatic basal cells. Mod Pathol. 2002 Dec;15(12):1302–8.
pathologyoutlines.com/topic/stainsp63.html
nordiqc.org/epitope.php?id=62