Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии

info@histotechnology.ru

anti-CD8 — Антитела к ко-рецептору Т-клеточного рецептора

I - Integrity - Целостность.

K - Knowledge - Знание.

O - Optimization - Оптимизация.

N - Necessity - Необходимость.

I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-CD8

Антитела к CD8 — ко-рецептору Т-клеточного рецептора (TCR). Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-CD8

Антитело к CD8 (anti-CD8) вступает в реакцию с трансмембранным гликопротеином CD8, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов главного комплекса гистосовместимости I класса и функционирует как ко-рецептор Т-клеточного рецептора. CD8 экспрессируется в супрессорных/цитотоксических Т-лимфоцитах, а также в некоторых NK-клетках. Молекула может принимать участие в запуске и регулировании аутоиммунных реакций и служит диагностическим маркером Т/NK-клеточных лимфом.

CD8-позитивны в норме:

кортикальные тимоциты (70–80 %);
Т-клетки (25–35 % зрелых периферических Т-клеток, в основном цитотоксические);
NK-клетки (около 30 %);
дендритные клетки.

CD8-позитивные опухоли:

опухоли из предшественников Т-клеток (Т-лимфобластный лейкоз/лимфома);
Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз;
первичная кожная акральная CD8+ Т-клеточная лимфома;
кожная CD8+ агрессивная эпидермотропная Т-клеточная лимфома;
Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов;
CD8+ грибовидный микоз;
первичная кожная агрессивная эпидермотропная цитотоксическая Т-клеточная лимфома;
лимфоматоидный папулёз (тип D);
первичная кожная анапластическая крупноклеточная лимфома;
подкожная панникулитоподобная Т-клеточная лимфома;
первичная кожная Т-клеточная лимфома, БДУ (цитотоксический вариант);
мономорфная эпителиотропная кишечная Т-клеточная лимфома;
ВЭБ-позитивная Т- и NK-клеточная лимфома;
периферическая Т-клеточная лимфома, БДУ.

CD8-негативные опухоли:

нодальные лимфомы из фолликулярных Т-хелперов;
Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых;
опухоли из предшественников В-клеток;
опухоли из зрелых В-лимфоцитов;
лимфома Ходжкина.

Ключевой принцип: anti-CD8 применяется как маркер для подтверждения цитотоксической Т-клеточной или NK-клеточной линии дифференцировки и интерпретируется в связке с CD3, CD4, CD56, TIA-1, Granzyme B и другими линей-специфическими маркерами.

Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Мембрана клеток

Оптимальный позитивный и негативный контроль

В качестве положительного и отрицательного тканевого контроля рекомендуется использовать миндалину и аппендикс. При правильно валидированном иммуногистохимическом протоколе в миндалинах практически все супрессорные/цитотоксические Т-клетки имеют выраженное отчётливое мембранное окрашивание. Отсутствует окрашивание в других клетках, включая В-клетки, стромальные клетки или плоские эпителиальные клетки миндалины.

В аппендиксе супрессорные/цитотоксические Т-клетки демонстрируют выраженное отчётливое мембранное окрашивание. Положительно окрашенные клетки располагаются рассеянно преимущественно в собственной пластинке слизистой оболочки, но также локализуются в эпителии аппендикса. Эпителиальные клетки должны быть не окрашены.

Комментарий: в миндалинах и аппендиксе отсутствуют нормальные тканевые структуры, демонстрирующие низкий уровень экспрессии CD8, поэтому рекомендуется включать селезёнку в контрольный мультиблок. В селезёнке литоральные клетки (клетки, которые в норме выстилают венозные синусы красной пульпы) должны демонстрировать по крайней мере умеренную интенсивность окрашивания.

Миндалина или аппендикс + селезёнка — для рутинного протокола.
Миндалина + аппендикс + селезёнка + периферическая Т-клеточная лимфома + карцинома молочной железы — для валидации протокола исследования.

Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:

Периферическая Т-клеточная лимфома — выраженное чёткое мембранное окрашивание подавляющего большинства опухолевых клеток.
Карцинома молочной железы — опухолевые клетки не окрашиваются; реакция ограничена рассеянными инфильтрирующими цитотоксическими Т-лимфоцитами.
Миндалина и аппендикс — служат внутренним позитивным контролем: цитотоксические Т-клетки должны быть ярко мембранно-позитивны, эпителий и В-клетки — негативны.
Селезёнка — литоральные клетки синусоидов красной пульпы должны демонстрировать как минимум умеренную мембраноподобную реакцию окрашивания.

Примеры окрашивания

Каждое изображение можно заменить — для этого измените атрибут src у соответствующего тега <img>.

Миндалина, окраска гематоксилином и эозином

Миндалина, H&E. В миндалине присутствует покровный многослойный плоский эпителий, лимфоидные фолликулы со светлыми центрами. Препарат окрашен оптимально: отсутствуют признаки неравномерного окрашивания, недостаточной фиксации и проводки. Типичный диапазон окрашивания ядер: мелкие лимфоциты с конденсированным хроматином, более крупные лимфоидные клетки — со светлым хроматином, чёткими ядерными мембранами и эозинофильными ядрышками.

Червеобразный отросток, окраска гематоксилином и эозином

Червеобразный отросток, H&E. В аппендиксе присутствуют все слои, ганглионарные клетки. Покровный эпителий и эпителий крипт не разрушен и не десквамирован. Лимфоидные узелки со светлым герминативным центром, ганглионарные клетки присутствуют. Препарат окрашен оптимально: отсутствуют признаки неравномерного окрашивания, недостаточной фиксации и проводки.

Оптимальное окрашивание миндалины CD8. Все цитотоксические Т-клетки демонстрируют ярко выраженное мембранное окрашивание, тогда как нецитотоксические Т-клетки и В-клетки не окрашены.

Неоптимальное окрашивание CD8 в миндалине

Неоптимальное окрашивание миндалины CD8. Интенсивность окрашивания слишком слабая, а положительные цитотоксические Т-клетки демонстрируют «неправильную» и непоследовательную мембранную реакцию.

Оптимальное окрашивание CD8 в аппендиксе

Оптимальное окрашивание аппендикса CD8. Практически все цитотоксические Т-клетки, расположенные в собственной слизистой оболочке, демонстрируют выраженное отчётливое мембранное окрашивание. В эпителии аппендикса также обнаруживаются рассеянные цитотоксические Т-клетки. Эпителиальные клетки не окрашены.

Оптимальное окрашивание селезёнки CD8. Все литоральные клетки, выстилающие синусоиды, демонстрируют умеренную и отчётливую реакцию окрашивания, тогда как Т-клетки с цитотоксической активностью выражены сильно.

Неоптимальное окрашивание CD8 в селезёнке

Неоптимальное окрашивание селезёнки CD8. Интенсивность окрашивания литоральных клеток слишком слабая, что может приводить к ложноотрицательной интерпретации низкоуровневой экспрессии CD8.

Параметр	Ventana / Roche (SP239)	Dako / Agilent (C8/144B)	Leica Biosystems (4B11)
Клон	SP239	C8/144B	4B11
Производитель	Ventana / Roche	Dako / Agilent	Leica Biosystems
№ продукта / № лота	790-7176 / K09185	M7103 / 20071297	NCL-L-CD8-4B11 / 6110766
Формат	Ready-To-Use (prediluted)	Concentrate	Concentrate
Дилюент	Нет	Antibody Diluent	Antibody Diluent with Casein
Производитель дилюента / №	—	Dako / K8006	Ventana / 760-219
Титр	—	1:300	1:100
Время инкубации / температура	32 мин / 36 °C	32 мин / 36 °C	32 мин / 37 °C

Параметр	Ventana / Roche (SP239)	Dako / Agilent (C8/144B)	Leica Biosystems (4B11)
Прибор	On Board / On Machine	On Board / On Machine	On Board / On Machine
Буфер	Ventana Ultra CC1	Ventana Ultra CC1	Ventana Ultra CC1
Время нагрева при макс. температуре	64 мин	48 мин	64 мин
Максимальная температура нагрева	95 °C	99 °C	95 °C

Параметр	Ventana / Roche (SP239)	Dako / Agilent (C8/144B)	Leica Biosystems (4B11)
Производитель	Ventana	Ventana	Ventana
Продукт / номер	UltraView Universal DAB Detection Kit / 760-500	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации линкера	—	8 мин	8 мин
Время инкубации полимера	8 мин	8 мин	8 мин
Температура инкубации	36 °C	36 °C	21 °C

Параметр	Ventana / Roche (SP239)	Dako / Agilent (C8/144B)	Leica Biosystems (4B11)
Производитель	Ventana	Ventana	Ventana
Продукт / номер	UltraView Universal DAB Detection Kit / 760-500	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700	OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура	12 мин / 36 °C	4 мин / 36 °C	8 мин / 21 °C
Усилитель	Нет	CuSO₄	CuSO₄

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

Следующим шагом протестируйте первичное антитело в серии разведений, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить реагент и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

Уменьшите концентрацию первичных антител.
Сократите время инкубации первичных антител.
Сократите время инкубации вторичных антител.
Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

Уменьшите концентрацию первичных антител.
Сократите время инкубации первичных антител.
Сократите время инкубации вторичных антител.
Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.
Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

Увеличьте концентрацию первичных антител.
Увеличьте время инкубации первичного антитела.
Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
Усильте блокирование фонового окрашивания.
Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

Усильте блокирование фонового окрашивания.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

Следуйте общим подходам шаг за шагом.
Попробуйте различные методы поиска антигена.
Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
Используйте другое первичное антитело.

Примечание

Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Кандидат биологических наук, Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

Mason DY, Cordell JL, Gaulard P, Tse AG, Brown MH. Immuno-histological detection of human cytotoxic/suppressor T cells using antibodies to a CD8 peptide sequence. J Clin Pathol. 1992 Dec;45(12):1084-8.
Patey-Mariaud de Serre N, Cellier C, Jabri B et al. Distinction Between Coeliac Disease and Refractory Sprue: A Simple Immunohistochemical Method. Histopathology. 2000;37:70-77.
Williamson SL, Steward M, Milton I, Parr A, Piggott NH, Krajewski AS, Angus B, Horne CH. New monoclonal antibodies to the T cell antigens CD4 and CD8. Production and characterization in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Am J Pathol. 1998 Jun;152(6):1421-6.
nordiqc.org
pathologyoutlines.com