anti-CD5 — Антитела к пан-Т-клеточному маркёру (SRCR-семейство)
I - Integrity - Целостность.
K - Knowledge - Знание.
O - Optimization - Оптимизация.
N - Necessity - Необходимость.
I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-CD5

Антитела к CD5 — пан-Т-клеточному маркёру из суперсемейства рецепторов, богатых цистеином (SRCR). Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

anti-CD5 — иммуногистохимическое окрашивание ткани
Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-CD5

Антитело к CD5 (anti-CD5) вступает в реакцию с трансмембранным гликопротеином CD5, который является пан-Т-клеточным маркером, принадлежащим к суперсемейству рецепторов, богатых цистеином (SRCR — Scavenger Receptor Cysteine-Rich). Регулирует активацию и чувствительность Т-клеток к антигенам: выступает одновременно положительным и отрицательным регулятором передачи сигналов через Т-клеточный рецептор (TCR). Действует как негативный регулятор Т-клеточного рецептора, подавляя чрезмерную передачу сигналов и тем самым предотвращая избыточную активацию Т-клеток. Участвует в дифференцировке и регуляции подтипа В-клеток.

CD5 экспрессируется на поверхности практически всех зрелых Т-клеток человека (около 10 % CD4⁺ Т-клеток являются CD5-отрицательными). В незрелых (CD34⁺) Т-клетках CD5 экспрессируется слабо, интенсивность экспрессии возрастает по мере созревания. CD5 также экспрессируется на поверхности небольшого количества нормальных В-клеток человека: примерно 20 % В-клеток в периферической крови и отдельные клетки в мантийной зоне лимфатических узлов.

CD5-позитивны в норме: почти все зрелые Т-клетки, а также небольшая подгруппа нормальных В-клеток в периферической крови (у взрослых) и в пуповинной крови.

CD5-позитивные опухоли: хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфома (ХЛЛ/ХЛЛЛ), лимфома из клеток зоны мантии, тимическая карцинома, карцинома щитовидной железы с тимусоподобной дифференцировкой (CASTLE). В редких случаях экспрессия CD5 может быть обнаружена при атипической тимоме, лимфоме Беркитта, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме (около 10 % случаев), фолликулярной лимфоме, лимфоплазмоцитарной лимфоме, Т- и NK-клеточных лимфомах, MALT-лимфоме.

CD5-негативные опухоли: Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией; Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов; большинство В-клеточных лимфом (за исключением ХЛЛ/ХЛЛЛ и лимфомы из клеток зоны мантии, а также редких случаев с аберрантной экспрессией CD5); клетки Рид — Штернберга при лимфоме Ходжкина.

Ключевой принцип: anti-CD5 применяется как пан-Т-клеточный маркёр и одновременно служит индикатором В-клеточных лимфом с характерной CD5-коэкспрессией (ХЛЛ/ХЛЛЛ, лимфома из клеток зоны мантии). Интерпретация требует связки с CD3, CD20, CD23, Cyclin D1 и другими линейными маркёрами.
Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Мембрана клеток

Оптимальный позитивный и негативный контроль

В качестве положительной и отрицательной контрольной ткани рекомендуется использовать миндалину. При правильно валидированном иммуногистохимическом протоколе рассеянные В-клетки в мантийной зоне вторичных фолликулов должны иметь слабое или умеренное, но отчётливое мембранное окрашивание. Т-клетки окрашиваются интенсивно. В клетках зародышевого центра окрашивание должно отсутствовать. Доля CD5-позитивных В-клеток в мантийной зоне может варьироваться от миндалины к миндалине, но главным аспектом является демонстрация чётких мембран отдельных клеток.

При оценке следует помнить, что рассеянные Т-клетки в зародышевом центре и в межфолликулярных зонах служат внутренним позитивным контролем — их яркое мембранное окрашивание должно сохраняться в каждом прогоне. Эпителиальные клетки и клетки зародышевых центров служат внутренним негативным контролем — их окрашивание должно отсутствовать.

  • Миндалина — для рутинного протокола.
  • Миндалина + аппендикс + лимфома маргинальной зоны + диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома — для валидации протокола.
Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:
  • Лимфома маргинальной зоны — негативна по CD5; положительны лишь рассеянные реактивные Т-клетки в опухолевом инфильтрате.
  • Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома — в подавляющем большинстве случаев CD5-негативна; позитивность опухолевых клеток ожидается лишь в небольшой доле (~10 %) случаев с аберрантной экспрессией.
  • Миндалина и аппендикс — внутренний позитивный контроль: Т-клетки ярко мембранно-позитивны, рассеянные В-клетки мантийной зоны дают слабое/умеренное мембранное окрашивание, эпителий и зародышевые центры — негативны.

Рекомендуемый протокол иммуногистохимического окрашивания

Первичное антитело

Параметр Ventana / Roche (SP19, лот J07799) Ventana / Roche (SP19, лот J24845) Cell Marque (SP19)
КлонSP19SP19SP19
ПроизводительVentana / RocheVentana / RocheCell Marque
№ продукта / № лота790-4451 / J07799790-4451 / J24845205R-14 / 205R-15 / 205R / 243200
ФорматReady-To-Use (prediluted)Ready-To-Use (prediluted)Concentrate
ДилюентНетНетAntibody Diluent
Производитель дилюента / №——Dako / K8006
Титр——1:50
Время инкубации / температура16 мин / 36 °C16 мин / 36 °C32 мин / 36 °C

Извлечение эпитопа, HIER

Параметр Ventana / Roche (SP19, лот J07799) Ventana / Roche (SP19, лот J24845) Cell Marque (SP19)
ПриборOn Board / On MachineOn Board / On MachineOn Board / On Machine
БуферVentana Ultra CC1Ventana Ultra CC1Ventana Ultra CC1
Время нагрева при макс. температуре64 мин64 мин48 мин
Максимальная температура нагрева100 °C95 °C99 °C

Система визуализации

Параметр Ventana / Roche (SP19, лот J07799) Ventana / Roche (SP19, лот J24845) Cell Marque (SP19)
ПроизводительVentanaVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700UltraView Universal DAB Detection Kit / 760-500OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Инкубация линкера8 мин—8 мин
Инкубация полимера8 мин8 мин8 мин
Температура инкубации36 °C36 °C36 °C

Хромоген

Параметр Ventana / Roche (SP19, лот J07799) Ventana / Roche (SP19, лот J24845) Cell Marque (SP19)
ПроизводительVentanaVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700UltraView Universal DAB Detection Kit / 760-500OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C8 мин / 36 °C8 мин / 36 °C
УсилительCuSO₄CuSO₄CuSO₄

Иммуностейнер

Ventana / Roche (SP19, лот J07799) Ventana / Roche (SP19, лот J24845) Cell Marque (SP19)
Ventana Benchmark Ultra Ventana Benchmark Ultra Ventana Benchmark Ultra

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

  • Следующим шагом протестируйте первичное антитело в серии разведений, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить реагент и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

  • Увеличьте концентрацию первичных антител.
  • Увеличьте время инкубации первичного антитела.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.
Примечание

Ассоциация специалистов лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Юнусов Теймур Юнусович

Кандидат биологических наук, Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

  1. Arber DA, Weiss LM. CD5: A review. Applied Immunohistochemistry. 1995;3:1–22.
  2. De Leon ED, Alkan S, Huang JC, et al. Usefulness of an immunohistochemical panel in paraffin-embedded tissues for the differentiation of B-cell non-Hodgkin's lymphomas of small lymphocytes. Modern Pathology. 1998;11:1046–1051.
  3. Hardy RR. CD5 B cells, a fetal B cell lineage. Advances in Immunology. 1994;55:297–339.
  4. Hsi ED, Tubbs RR. Immunophenotyping as an adjunct in the diagnosis of small B-cell lymphomas. Pathology Case Reviews. 1999;4:242–249.
  5. pathologyoutlines.com
  6. nordiqc.org