anti-CD4 — Антитела к Т-хелперному маркеру
I - Integrity - Целостность.
K - Knowledge - Знание.
O - Optimization - Оптимизация.
N - Necessity - Необходимость.
I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-CD4

Антитела к CD4 — трансмембранному гликопротеину суперсемейства иммуноглобулинов, маркеру Т-хелперов/Т-индукторов. Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

anti-CD4 — иммуногистохимическое окрашивание ткани
Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-CD4

Антитело к CD4 (anti-CD4) вступает в реакцию с трансмембранным гликопротеином CD4, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов и связан с распознаванием антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса. CD4 экспрессируется на поверхности Т-хелперов/Т-индукторов, большинства тимоцитов, а также моноцитов, макрофагов, дендритных клеток и гранулоцитов. Антиген CD4 отсутствует у незрелых тимоцитов и появляется в процессе развития Т-клеток.

CD4 служит общим маркером Т-клеток; используется для классификации лимфом и воспалительных заболеваний. CD4 рекомендуется применять в комбинации с CD3, CD5, CD7, CD8 и bcl-2.

CD4-позитивны в норме: Т-хелперы/Т-индукторы, тимоциты (80–90 %), гранулоциты, макрофаги, клетки Лангерганса и дендритные клетки. Около 45 % лимфоцитов периферической крови CD4-позитивны. В лимфатической ткани CD4-позитивные Т-клетки в большом количестве присутствуют в парафолликулярных зонах, отдельные клетки — в зародышевых центрах и мантийных зонах. CD4-позитивные клетки также обнаруживаются в пристеночных клетках селезёнки и синусоидальных клетках печени. Иммунореактивность с CD4 с использованием антител к Leu3a и OKT4D выявлена как в нормальных, так и в аномальных паращитовидных железах.

CD4-позитивные опухоли: опухоли из предшественников Т-клеток (Т-лимфобластный лейкоз/лимфома), опухоли из зрелых Т-клеток (Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов, грибовидный микоз, синдром Сезари, лимфоматоидный папулёз, ALK-позитивная/ ALK-негативная анапластическая крупноклеточная лимфома, нодальные лимфомы из фолликулярных Т-хелперов), дендритно-клеточные и гистиоцитарные/макрофагальные новообразования (бластная опухоль из плазмоцитоидных дендритных клеток, ювенильная ксантогранулема, болезнь Эрдгейма — Честера), острый миелоидный лейкоз (М4, М5).

CD4-негативные опухоли: некоторые Т-клеточные лимфомы (энтеропатическая Т-клеточная лимфома, мономорфная эпителиотропная кишечная Т-клеточная лимфома, интестинальная Т-клеточная лимфома, БДУ, экстранодальная NK/Т-клеточная лимфома, первичная кожная агрессивная эпидермотропная CD8-позитивная цитотоксическая Т-клеточная лимфома), опухоли из предшественников В-клеток, опухоли из зрелых В-лимфоцитов, лимфома Ходжкина.

Ключевой принцип: anti-CD4 применяется для верификации Т-хелперной линии и как компонент панели при дифференциальной диагностике Т-клеточных лимфом и гистиоцитарных/дендритно-клеточных новообразований; интерпретация проводится в связке с CD3, CD8, CD7, CD5 и bcl-2.
Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Мембрана клеток

Оптимальный позитивный и негативный контроль

В качестве основного позитивного и негативного тканевого контроля рекомендуется использовать миндалину и печень. При правильно валидированном иммуногистохимическом протоколе Т-хелперы/индукторы имеют чёткое и яркое мембранное окрашивание. Макрофаги зародышевого центра должны окрашиваться как минимум умеренно и чётко. В других клетках, в том числе в В-клетках и эпителиальных клетках миндалины, окрашивание отсутствует.

Клетки Купфера и эндотелиальные клетки в синусоидных капиллярах печени при правильно подобранном протоколе должны окрашиваться как минимум умеренно и отчётливо; гепатоциты не окрашиваются или окрашиваются слабо.

В качестве дополнительной контрольной ткани возможно использовать червеобразный отросток. Все Т-хелперные/индукторные клетки демонстрируют сильную и отчётливую реакцию мембранного окрашивания; макрофаги зародышевого центра проявляют слабую или умеренную интенсивность. В В-клетках и эпителиальных клетках аппендикса реакция окрашивания не наблюдается.

  • Миндалина + печень — для рутинного протокола.
  • Миндалина + аппендикс + печень + лимфома маргинальной зоны + диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома — для валидации протокола исследования.
Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:
  • Лимфома маргинальной зоны и диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома — служат внутренним негативным контролем: опухолевые клетки не должны окрашиваться, допускается окрашивание рассеянных реактивных Т-хелперов.
  • Миндалина и аппендикс — внутренний позитивный контроль: Т-хелперы/индукторы и макрофаги зародышевых центров демонстрируют мембранное окрашивание, В-клетки и эпителий — негативны.
  • Печень — клетки Купфера и эндотелий синусоидных капилляров окрашиваются мембранно; гепатоциты — негативны или слабо позитивны.

Рекомендуемый протокол иммуногистохимического окрашивания

Первичное антитело

Параметр Roche (SP35) Cell Marque (SP35)
КлонSP35SP35
ПроизводительRocheCell Marque
№ продукта / № лота790-4423 / J14781104R-14/15-16 / 153754
ФорматReady-To-Use (prediluted)Concentrate
ДилоентНетAntibody Diluent
Производитель дилоента / №—Dako / K8006
Титр—1:50
Время инкубации / температура24 мин / 36 °C32 мин / 36 °C

Извлечение эпитопа, HIER

ПараметрRoche (SP35)Cell Marque (SP35)
ПриборOn Board / On MachineOn Board / On Machine
БуферVentana Ultra CC1Ventana Ultra CC1
Время нагрева при макс. температуре32 мин48 мин
Максимальная температура нагрева100 °C99 °C

Система визуализации

ПараметрRoche (SP35)Cell Marque (SP35)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации линкера8 мин8 мин
Время инкубации полимера8 мин8 мин
Температура инкубации36 °C36 °C

Хромоген

ПараметрRoche (SP35)Cell Marque (SP35)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C4 мин / 36 °C
УсилительCuSO₄CuSO₄

Иммуностейнер

Ventana Benchmark UltraVentana Benchmark Ultra

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

  • Следующим шагом протестируйте первичное антитело в серии разведений, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить реагент и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

  • Увеличьте концентрацию первичных антител.
  • Увеличьте время инкубации первичного антитела.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.
Примечание

Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Юнусов Теймур Юнусович

Кандидат биологических наук, Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

  1. Gaubin M, Autiero M, Houlgatte R, Basmaciogullari S, Auffray C, Piatier-Tonneau D. Molecular basis of T lymphocyte CD4 antigen functions. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1996;34:723.
  2. Kisielow P, von Boehmer H. Development and selection of T cells: facts and puzzles. Adv Immunol. 1995;58:87.
  3. Mazerolles F, Auffray C, Fischer A. Downregulation of T-cell adhesion by CD4. Hum Immunol. 1991;31:40.
  4. Namimatsu S, Ghazizadeh M, Sugisaki Y. Reversing the effects of formalin fixation with citraconic anhydride and heat: a universal antigen retrieval method. J Histochem Cytochem. 2005 Jan;53(1):3–11.
  5. Sattentau QJ, Weiss RA. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 1988;52:631.
  6. Williamson SL, Steward M, Milton I, Parr A, Piggott NH, Krajewski AS, Angus B, Horne CH. New monoclonal antibodies to the T cell antigens CD4 and CD8. Production and characterization in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Am J Pathol. 1998 Jun;152(6):1421–6.
  7. pathologyoutlines.com
  8. nordiqc.org