Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии

info@histotechnology.ru
ВСТУПИТЬ В АССОЦИАЦИЮ
anti-Pan CK — Антитела к мультицитокератинам
I - Integrity - Целостность.
K - Knowledge - Знание.
O - Optimization - Оптимизация.
N - Necessity - Необходимость.
I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-Pan CK

Антитела к мультицитокератинам. Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

anti-Pan CK — иммуногистохимическое окрашивание ткани
Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-Pan CK

Смесь двух клонов моноклональных антител против цитокератинов (AE1 и AE3) вступает в реакцию с кислыми и щелочными промежуточными филаментными белками, которые являются структурой цитоскелета эпителиальных клеток — высокомолекулярными цитокератинами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 14, 15 и 16 и низкомолекулярными цитокератинами 7, 8 и 19. В смеси реагента отсутствуют антитела к цитокератинам 17 и 18.

Мультицитокератиновые антитела реагируют с различными типами эпителия, клетками трофобласта, фолликулярными клетками аденогипофиза и печенью. В печени гепатоциты демонстрируют слабую и умеренную, преимущественно мембранозную реакцию, а эпителий желчных протоков — выраженное цитоплазматическое окрашивание.

Большинство доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолей, а также мезотелиомы — Pan-CK-позитивны. Положительное окрашивание может встречаться и в ряде неэпителиальных опухолей: герминогенные опухоли, глиомы, хордома, эпителиоидная саркома, тимома и др. В связи с этим anti-Pan CK редко используется как самостоятельный маркер и чаще применяется в составе широкой панели для подтверждения или исключения эпителиальной природы опухоли.

Ключевой принцип: результат anti-Pan CK необходимо интерпретировать в контексте морфологии и остальных маркеров диагностической панели.
Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Цитоплазма и мембрана клеток

Оптимальный позитивный и негативный контроль

В качестве положительного контроля для мультицитокератина рекомендуется использовать в сочетании печень и миндалину. Крайне важно, чтобы подавляющее большинство гепатоцитов демонстрировали как минимум умеренную, отчётливую реакцию окрашивания цитоплазмы и мембран. В эпителии желчных протоков — сильное цитоплазматическое окрашивание. Стромальные клетки печени не должны окрашиваться.

Согласно рекомендациям Международного экспертного комитета, миндалину можно использовать и как положительный, и как отрицательный тканевой контроль. Все клетки многослойного плоского эпителия должны давать умеренную или сильную цитоплазматическую реакцию, а лимфоциты — не должны реагировать. Диспергированные клетки интерстициального ретикулума могут давать слабую или умеренную реакцию из-за низкого уровня экспрессии креатинкиназы.

  • Печень + миндалина — для рутинного протокола.
  • Печень + аппендикс + аденокарцинома лёгкого + плоскоклеточная карцинома лёгкого + светлоклеточная карцинома почки + диффузная В-крупноклеточная лимфома — для валидации протокола.
Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:
  • Плоскоклеточный рак лёгкого и аденокарцинома — сильное чёткое цитоплазматическое окрашивание почти всех опухолевых клеток.
  • Светлоклеточная карцинома почки — окрашивание от слабого до умеренного.
  • В-крупноклеточная лимфома — опухолевые клетки не окрашиваются.

Рекомендуемый протокол иммуногистохимического окрашивания

Первичное антитело

Параметр Ventana / Roche Biocare Medical Dako / Agilent
КлонAE1/AE3/PCK26AE1/AE3 + 5D3AE1/AE3
№ продукта / № лота760-2135 / F07799CM 162 A, B или C / 042018M3515 / 10146500
ФорматReady-To-Use (prediluted)ConcentrateConcentrate
Производитель дилюента / №—Dako / K8006Ventana / 251-018
Разведение—1:501:100
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C32 мин / 36 °C32 мин / 36 °C

Извлечение эпитопа, HIER

ПараметрVentana / RocheBiocare MedicalDako / Agilent
ПриборOn Board / On MachineOn Board / On MachineOn Board / On Machine
БуферVentana CC1Ventana CC1Ventana Ultra CC1
Время нагрева при макс. температуре36 мин48 мин64 мин
Максимальная температура нагрева95 °C100 °C100 °C

Извлечение эпитопа, ферментом

ПараметрVentana / RocheBiocare MedicalDako / Agilent
ФерментПротеаза 3нетнет
Производитель / №Ventana / 760-2020нетнет
Время инкубации / температура8 мин / 36 °Cнетнет

Система визуализации

ПараметрVentana / RocheBiocare MedicalDako / Agilent
ПроизводительVentanaVentanaVentana
Продукт / номерUltraView Universal DAB / 760-500OptiView DAB IHC / 760-700OptiView DAB IHC / 760-700
Инкубация линкеранет8 мин8 мин
Инкубация полимера8 мин12 мин8 мин
Температура инкубации36 °C36 °C36 °C

Хромоген

ПараметрVentana / RocheBiocare MedicalDako / Agilent
ПроизводительVentanaVentanaVentana
Продукт / номерUltraView Universal DAB / 760-500OptiView DAB IHC / 760-700OptiView DAB IHC / 760-700
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C8 мин / 36 °C8 мин / 36 °C
УсилительCuSO₄CuSO₄CuSO₄

Иммуностейнер

Ventana Benchmark UltraVentana Benchmark UltraVentana Benchmark Ultra

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

  • Тестируйте первичное антитело в серии разведений — выберите наивысшее разведение с оптимальным результатом.

Сильный сигнал, слабый фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных и вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных и вторичных антител.
  • Заблокируйте фон, попробуйте другой метод поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.

Слабый сигнал, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител, сократите время инкубации.
  • Усильте блокирование фона.
  • Используйте более чувствительную систему детекции или другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

  • Усильте блокирование фона.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте другой метод поиска антигена или другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте другой метод поиска антигена и более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь в техническую поддержку поставщика.

Сигнала нет, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте другой метод поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь в техподдержку поставщика.

Сигнала нет, сильный фон

  • Попробуйте другой метод поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь в техподдержку поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.
Примечание

Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержание и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Юнусов Теймур Юнусович

Кандидат биологических наук, Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

  1. Moll R, Franke WW, Schiller DL, Geiger B, Krepler R. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell. 1982;31:11–24.
  2. Chu PG, Weiss LM. Keratin expression in human tissues and neoplasms. Histopathology. 2002;40(5):403–39.
  3. Schweizer J, Bowden PE, Coulombe PA, et al. New consensus nomenclature for mammalian keratins. J Cell Biol. 2006;174(2):169–74.
  4. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 2008;129(6):705–33.
  5. Chu PG, Lau SK, Weiss LM. Keratin expression in endocrine organs and their neoplasms. Endocr Pathol. 2009;20(1):1–10.
  6. Miettinen M, Fetsch JF. Distribution of keratins in normal endothelial cells and a spectrum of vascular tumors. Hum Pathol. 2000;31(9):1062–7.
  7. Skinnider BF, Folpe AL, Hennigar RA, et al. Distribution of cytokeratins and vimentin in adult renal neoplasms and normal renal tissue. Am J Surg Pathol. 2005;29(6):747–54.
  8. Carrilho C, Alberto M, Buane L, David L. Keratins 8, 10, 13, and 17 are useful markers in the diagnosis of human cervix carcinomas. Hum Pathol. 2004;35(5):546–51.
  9. Smedts F, Ramaekers F, Robben H, et al. Changing patterns of keratin expression during progression of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Pathol. 1990;136(3):657–68.
  10. Matthias C, Mack B, Berghaus A, Gires O. Keratin 8 expression in head and neck epithelia. BMC Cancer. 2008;8:267.
  11. Böcker W, Hungermann D, Weigel S, Tio J, Decker T. Immunohistochemistry in breast pathology. Pathologe. 2009;30(1):13–9.
  12. Mackinder MA, Evans CA, Chowdry J, et al. Alteration in composition of keratin intermediate filaments in a model of breast cancer progression. Cancer Biomark. 2012;12(2):49–64.
  13. pathologyoutlines.com
  14. nordiqc.org