Ассоциация специалистов в области лабораторной гистотехнологии

info@histotechnology.ru
ВСТУПИТЬ В АССОЦИАЦИЮ
anti-p53 — Антитела к белку-супрессору опухолевого роста p53 (мутантные паттерны, ВПЧ-ассоциированный паттерн)
I - Integrity - Целостность.
K - Knowledge - Знание.
O - Optimization - Оптимизация.
N - Necessity - Необходимость.
I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-p53

Антитела к белку-супрессору опухолевого роста p53 — ядерному маркёру, позволяющему выявлять мутантные паттерны экспрессии и ВПЧ-ассоциированный базально-сберегающий паттерн. Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала.

anti-p53 — иммуногистохимическое окрашивание
Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-p53

Anti-p53 — это антитело к белку p53, который является белком-супрессором опухолей, кодируемым геном TP53 на 17-й хромосоме. Обнаружив повреждение ДНК, p53 связывается с ДНК и временно приостанавливает клеточный цикл, чтобы обеспечить восстановление. Если повреждение не удаётся устранить, p53 запускает апоптоз.

Мутации в гене TP53 нарушают функцию белка p53, подавляющего развитие опухолей. Такие мутации наблюдаются примерно в 50% случаев всех злокачественных новообразований. При отсутствии мутаций белок p53 проявляет характерный для дикого типа паттерн, при котором опухолевые клетки демонстрируют неоднородную реакцию окрашивания ядра, обычно от слабой до умеренной интенсивности.

Ключевой принцип: anti-p53 используется как суррогатный маркёр мутационного статуса TP53. Аберрантные паттерны окрашивания (избыточная экспрессия, полное отсутствие реакции, цитоплазматический паттерн) указывают на наличие мутации, тогда как гетерогенное слабое/умеренное ядерное окрашивание соответствует дикому типу. Базально-сберегающий паттерн позволяет предполагать ВПЧ-ассоциированный процесс с инактивацией p53 онкобелком E6.

Иммуногистохимические паттерны p53

Интерпретация окрашивания p53 строится на распознавании характерных паттернов, каждый из которых имеет своё клиническое и биологическое значение.

Паттерны, указывающие на мутацию в гене TP53

Избыточная экспрессия

Равномерное, интенсивное окрашивание ядер. При определённых подтипах сверхэкспрессии наблюдается градиент от базальной части к поверхности, при этом интенсивность окрашивания снижается от сильного до слабого/отрицательного, что может свидетельствовать о том, что клетки навсегда выходят из клеточного цикла.

Базальная гиперэкспрессия

Равномерное, интенсивное окрашивание ядер базальных клеток без выраженной парабазальной реакции в плоском эпителии.

Терминальная дифференцировка

По мере приближения к поверхности окрашивание ослабевает и в железистом эпителии исчезает.

Отсутствие экспрессии

Полное отсутствие реакции окрашивания в опухолевых клетках, в то время как фоновые стромальные клетки, лимфоциты и эндотелиальные клетки окрашиваются в соответствии с нормой.

Цитоплазматический паттерн

Цитоплазматическое окрашивание без реакции окрашивания ядра в опухолевых клетках.

Паттерн, указывающий на ВПЧ-инфекцию

Базально-сберегающий паттерн

Полное отсутствие реакции окрашивания в базальных клетках при гетерогенной реакции окрашивания ядер в средней части эпителия, что связано с ВПЧ-инфекцией и инактивацией p53 онкобелком E6.

Применение anti-p53

  • Для дифференцировки реактивных изменений и низкой степени интраэпителиальных новообразований слизистой оболочки или аденомы от высокой степени интраэпителиальных новообразований (p53+) в пищеводе (метаплазия Барретта), желудке, тонкой и толстой кишке.
  • Дифференцировка реактивных эпителиальных изменений от уротелиальной карциномы высокой степени злокачественности in situ (p53+).
  • Обнаружение высокозлокачественных интраэпителиальных новообразований или раковых клеток при тонкоигольной аспирационной биопсии поджелудочной железы (p53+).
  • Дифференцировка серозной карциномы яичников низкой и высокой степени злокачественности (аберрантный p53+).
  • Дифференциация подтипов глиомы и медуллобластомы.
  • Определение необходимости обследования детей с карциномой сосудистого сплетения на наличие синдрома Ли — Фраумени.
  • Дифференциация прогностических подгрупп при плоскоклеточной карциноме вульвы.
  • Суррогатный маркер для классификации карцином эндометрия по высокому уровню копийности TCGA.
  • Выявление независимой от ВПЧ дифференцированной интраэпителиальной неоплазии вульвы (dVIN).
  • Дифференцировка серозной тубоэпителиальной карциномы (STIC) от реактивных изменений в эпителии фаллопиевых труб или бахромки — важна гистологическая дифференциация, так как серозные тубоэпителиальные поражения также могут иметь аберрантный фенотип p53.
Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Ядро клеток

Оптимальная позитивная и негативная контрольная ткань

Рекомендуемые позитивная и негативная контрольные ткани — это червеобразный отросток и миндалина. В миндалине более 50% В-клеток зародышевого центра должны давать слабую или умеренную реакцию ядерного окрашивания, в то время как менее 50% В-клеток мантийной зоны должны давать реакцию ядерного окрашивания.

В аппендиксе рассеянные эпителиальные клетки в базальных частях крипт должны демонстрировать слабое или умеренное ядерное окрашивание; покровный эпителий и эпителий остальной части крипт не окрашиваются.

  • Червеобразный отросток + миндалина — для рутинного исследования.
  • Червеобразный отросток + миндалина + эндометриоидная аденокарцинома низкой степени злокачественности (окрашивание по дикому типу p53) + серозная карцинома (с отсутствием экспрессии p53) + серозная карцинома (гиперэкспрессия p53) — для валидации протокола.
Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:
  • Червеобразный отросток — рассеянные эпителиальные клетки базальных отделов крипт демонстрируют слабое или умеренное ядерное окрашивание, отчётливо видимое при малом увеличении; покровный эпителий и эпителий остальной части крипт негативны.
  • Миндалина — более 50% В-клеток зародышевого центра демонстрируют слабую или умеренную ядерную реакцию, менее 50% В-клеток мантийной зоны — реакцию ядерного окрашивания; фоновые лимфоциты позитивны согласно норме.
  • Эндометриоидная аденокарцинома низкой степени злокачественности — гетерогенное ядерное окрашивание дикого типа, от слабого до умеренного, неоднородное по интенсивности.
  • Серозная карцинома с отсутствием экспрессии — полное отсутствие ядерной реакции в опухолевых клетках при нормальном окрашивании стромы, лимфоцитов и эндотелия.
  • Серозная карцинома с гиперэкспрессией — равномерное интенсивное ядерное окрашивание в подавляющем большинстве опухолевых клеток.

Рекомендуемый протокол иммуногистохимического окрашивания

Первичное антитело

Параметр Ventana / Roche (D0-7) Ventana / Roche (Bp-53-11)
КлонD0-7Bp-53-11
ПроизводительVentanaVentana
№ продукта / № лота800-2912 / —760-2542 / K10422
ФорматReady-To-Use (prediluted)Ready-To-Use (prediluted)
ДилюентНетНет
Дилюент № продукта / № лота——
Разведение——
Время инкубации / температура32 мин / 36 °C32 мин / 36 °C

Извлечение эпитопа, HIER

Параметр Ventana / Roche (D0-7) Ventana / Roche (Bp-53-11)
ПриборOn Board / On MachineOn Board / On Machine
БуферVentana Ultra CC1Ventana CC1
Время нагрева при макс. температуре48 мин64 мин
Максимальная температура нагрева100 °C100 °C

Система визуализации

Параметр Ventana / Roche (D0-7) Ventana / Roche (Bp-53-11)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Инкубация линкера8 мин8 мин
Инкубация полимера8 мин8 мин
Температура инкубации36 °C36 °C

Хромоген

Параметр Ventana / Roche (D0-7) Ventana / Roche (Bp-53-11)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C8 мин / 36 °C
УсилительCuSO₄CuSO₄

Иммуностейнер

Ventana / Roche (D0-7) Ventana / Roche (Bp-53-11)
Ventana Benchmark Ultra Ventana Benchmark Ultra

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

  • Следующим шагом протестируйте первичное антитело в серии разведений, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить реагент и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.

Сильный сигнал, сильный фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте фоновое окрашивание.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

  • Увеличьте концентрацию первичных антител.
  • Увеличьте время инкубации первичного антитела.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

  • Усильте блокирование фонового окрашивания.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.
Примечание

Ассоциация специалистов лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Юнусов Теймур Юнусович

Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

  1. Hutchings D, Waters KM, Weiss MJ, Wolfgang CL, Makary MA, He J, Cameron JL, Wood LD, Hruban RH. Cancerization of the Pancreatic Ducts: Demonstration of a Common and Under-recognized Process Using Immunolabeling of Paired Duct Lesions and Invasive Pancreatic Ductal Adenocarcinoma for p53 and Smad4 Expression. Am J Surg Pathol. 2018 Nov;42(11):1556-1561. doi: 10.1097.
  2. Yemelyanova A, Vang R, Kshirsagar M, Lu D, Marks MA, Shih IM, Kurman RJ. Immunohistochemical staining patterns of p53 can serve as a surrogate marker for TP53 mutations in ovarian carcinoma: an immunohistochemical and nucleotide sequencing analysis. Mod Pathol. 2011 Sep;24(9):1248-53. doi: 10.1038/modpathol.2011.85. Epub 2011 May 6.
  3. Leonhardt K, Einenkel J, Sohr S, Engeland K, Horn LC. p53 signature and serous tubal in-situ carcinoma in cases of primary tubal and peritoneal carcinomas and serous borderline tumors of the ovary. Int J Gynecol Pathol. 2011 Sep;30(5):417-24.
  4. Sugimoto S, Uchiyama T, Kawahara N, Ohbayashi C, Kobayashi H. Immunohistochemical Expression Status of p53, CD44v9, and Ki-67 in a Series of Fallopian Tube Lesions of High-grade Serous Carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 2021 Sep 1;40(5):419-426.
  5. Liu YA, Ji JX, Almadani N, Crawford RI, Gilks CB, Kinloch M, Hoang L. Comparison of p53 immunohistochemical staining in differentiated vulvar intraepithelial neoplasia (dVIN) with that in inflammatory dermatoses and benign squamous lesions in the vulva. Histopathology. 2021 Feb;78(3):424-433. doi: 10.1111/his.14238. Epub 2020 Oct 27.
  6. pathologyoutlines.com/topic/stainsp63.html
  7. nordiqc.org/epitope.php?id=62