anti-CD20 — Антитела к трансмембранному белку CD20 (маркёр B-клеток, B-клеточные лимфомы)
I - Integrity - Целостность.
K - Knowledge - Знание.
O - Optimization - Оптимизация.
N - Necessity - Необходимость.
I.K.O.N. CONTROL · ПРОТОКОЛЫ К АНТИТЕЛАМ

При поддержке ООО «Рош Диагностика Рус».

anti-CD20

Антитела к трансмембранному негликозилированному белку CD20 — маркёру предшественников B-клеток и зрелых B-лимфоцитов. Практический протокол иммуногистохимического окрашивания, контроль качества и разбор типичных вариантов сигнала для диагностики B-клеточных лимфом.

anti-CD20 — иммуногистохимическое окрашивание B-клеток
Объект: ткани в парафиновом блоке

Что определяет anti-CD20

Антитело к CD20 (anti-CD20) вступает в реакцию с трансмембранным негликозилированным белком, который экспрессируется на предшественниках B-клеток и зрелых B-лимфоцитах. Экспрессия этого белка сохраняется на зрелых B-лимфоцитах до их дифференцировки в плазматические клетки.

CD20-позитивны в норме большинство B-клеток (считаются антигеном всех B-клеток), а также фолликулярные дендритные клетки. CD20-позитивны 90% B-клеточных лимфом при условии отсутствия лечения химерными моноклональными антителами к трансмембранному CD20-антигену (ритуксимаб), острый B-лимфобластный лейкоз/лимфома (40% случаев), лимфома Ходжкина нодулярная форма лимфоидного преобладания (80% случаев), классическая лимфома Ходжкина (20% случаев), мономорфная эпителиотропная кишечная T-клеточная лимфома (аберрантная экспрессия в 20% случаев), веретеноклеточные тимомы.

CD20-негативны опухоли из зрелых T-клеток (нодальные лимфомы из фолликулярных T-хелперов, ALK-позитивная/ALK-негативная анапластическая крупноклеточная лимфома, ВЭБ-позитивная T- и NK-клеточная лимфома), опухоли из предшественников T-клеток (T-лимфобластный лейкоз/лимфома).

Ключевой принцип: anti-CD20 — основной иммуногистохимический маркёр B-клеточной линии, применяемый для подтверждения B-клеточной природы новообразований и оценки мембранной экспрессии антигена перед назначением таргетной терапии ритуксимабом. Стоит обратить внимание, что все позитивные клетки имеют интенсивное окрашивание, что не позволяет определить чувствительность протокола по здоровым тканям — для оценки аналитической чувствительности необходимо включать лимфомы/лейкозы с низкой плотностью антигена CD20.

Иммуногистохимические паттерны CD20

Интерпретация окрашивания CD20 строится на оценке интенсивности мембранной реакции и сравнении её с фоновыми структурами. Ниже приведены основные паттерны, наблюдаемые в здоровой ткани и при патологических состояниях.

Паттерны в здоровой контрольной ткани

Сильная реакция в мантийной зоне

B-клетки мантийной зоны фолликулов миндалины и аппендикса демонстрируют очень сильную реакцию мембранного окрашивания. Это служит ориентиром для оценки верхнего порога чувствительности протокола.

Сильная реакция в зародышевом центре

B-клетки зародышевого центра фолликулов миндалины и аппендикса дают очень сильную мембранную реакцию, аналогичную мантийной зоне. Эпителиальные клетки не окрашиваются.

Рассеянные B-клетки в эпителии

В криптах червеобразного отростка и в покровном эпителии миндалины рассеянные B-клетки демонстрируют сильную, отчётливую реакцию мембранного окрашивания. Эпителиальные клетки негативны.

Негативный фон

Эпителиальные, эндотелиальные клетки и строма не окрашиваются, что подтверждает специфичность реакции и отсутствие фонового сигнала при корректно настроенном протоколе.

Паттерны в патологической ткани

B-клеточные лимфомы

До 90% B-клеточных лимфом демонстрируют сильную мембранную реакцию при условии отсутствия предшествующей терапии ритуксимабом. Неопластические B-клетки хронического лимфоцитарного лейкоза обычно показывают слабую или умеренную мембранную реакцию, что важно для оценки аналитической чувствительности.

Применение anti-CD20

  • Подтверждение B-клеточной природы новообразований при диагностике лимфом и лейкозов.
  • Идентификация нормальных и реактивных B-клеточных популяций в ткани миндалины, лимфатического узла, селезёнки и других лимфоидных органов.
  • Выявление аберрантной экспрессии CD20 в нодулярной форме лимфоидного преобладания лимфомы Ходжкина, классической лимфомы Ходжкина и мономорфной эпителиотропной кишечной T-клеточной лимфомы.
  • Дифференцировка B-клеточных и T-клеточных лимфом в спорных случаях.
  • Оценка экспрессии CD20 перед назначением таргетной терапии ритуксимабом и другими анти-CD20-препаратами.
  • Подтверждение диагноза острых B-лимфобластных лейкозов/лимфом (около 40% случаев).
  • Идентификация B-клеточных популяций в составе смешанных и составных лимфом.
  • Использование в качестве контроля B-клеточной популяции при оценке других маркёров (CD3, CD5, CD10, BCL2, BCL6, Ki-67).
Объект исследования

Ткани в парафиновом блоке

Локализация окрашивания

Мембрана клеток

Оптимальная позитивная и негативная контрольная ткань

Рекомендуемые позитивная и негативная здоровые контрольные ткани — это миндалина и аппендикс. B-клетки мантийной зоны и B-клетки зародышевого центра должны давать очень сильную реакцию окрашивания, другие клетки окрашиваться не должны. Стоит обратить внимание, что все позитивные клетки имеют интенсивное окрашивание, что не позволяет определить чувствительность протокола по здоровой ткани.

Для оценки аналитической чувствительности и валидации протокола рекомендуется включать в контрольный мультиблок лимфомы и лейкозы с наличием низкой плотности антигена CD20, в частности хронический B-клеточный лейкоз, демонстрирующий слабую или умеренную мембранную реакцию.

  • Миндалина или аппендикс + червеобразный отросток — для рутинного протокола.
  • Миндалина + червеобразный отросток + меланома + диффузная B-крупноклеточная лимфома + хронический B-клеточный лейкоз — для валидации протокола исследования.
Ожидаемый паттерн окрашивания в валидационном мультиблоке:
  • Миндалина — B-клетки мантийной зоны и B-клетки зародышевого центра демонстрируют очень сильную мембранную реакцию, эпителиальные клетки не окрашены.
  • Аппендикс/червеобразный отросток — практически все клетки мантийной зоны, зародышевого центра и рассеянные B-клетки демонстрируют сильную, отчётливую реакцию мембранного окрашивания, эпителиальные клетки не окрашены.
  • Меланома — отсутствие реакции CD20, мембранное окрашивание не наблюдается, что подтверждает специфичность протокола и валидирует отсутствие ложноположительного сигнала.
  • Диффузная B-крупноклеточная лимфома — сильная мембранная реакция подавляющего большинства неопластических B-клеток.
  • Хронический B-клеточный лейкоз — практически все неопластические B-клетки демонстрируют слабую или умеренную выраженную реакцию мембранного окрашивания, что позволяет оценить аналитическую чувствительность протокола.

Рекомендуемый протокол иммуногистохимического окрашивания

Первичное антитело

Параметр Ventana / Roche (L26) Dako / Agilent (L26)
КлонL26L26
ПроизводительVentana RocheDako / Agilent
№ продукта / № лота760-2531 / J30948M0755 / 20083766
ФорматReady-To-Use (prediluted)Concentrate
ДилюентНетAntibody Diluent
Производитель дилюента / №—Ventana / 251-018
Титр—1:500
Время инкубации / температура16 мин / 36 °C16 мин / 36 °C

Извлечение эпитопа, HIER

Параметр Ventana / Roche (L26) Dako / Agilent (L26)
ПриборOn Board / On MachineOn Board / On Machine
БуферVentana Ultra CC1Ventana CC1
Время нагрева при макс. температуре32 мин24 мин
Максимальная температура нагрева100 °C100 °C

Система визуализации

Параметр Ventana / Roche (L26) Dako / Agilent (L26)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации линкера8 мин8 мин
Время инкубации полимера8 мин8 мин
Температура инкубации36 °C36 °C

Хромоген

Параметр Ventana / Roche (L26) Dako / Agilent (L26)
ПроизводительVentanaVentana
Продукт / номерOptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700OptiView DAB IHC Detection Kit / 760-700
Время инкубации / температура8 мин / 36 °C10 мин / 36 °C
УсилительCuSO₄CuSO₄

Иммуностейнер

Ventana / Roche (L26) Dako / Agilent (L26)
Ventana Benchmark Ultra Ventana Benchmark Ultra

Разбор типичных вариантов сигнала

Сильный сигнал, фона нет

  • Следующим шагом является тестирование первичного антитела в многократных разведениях, чтобы получить наивысшее разведение с оптимальным результатом, сохранить первичное антитело и снизить затраты.

Сильный сигнал, слабый фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте окрашивание фона.

Сильный сигнал, сильный фон

  • Уменьшите концентрацию первичных антител.
  • Сократите время инкубации первичных антител.
  • Сократите время инкубации вторичных антител.
  • Дополнительно заблокируйте окрашивание фона.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, фона нет

  • Увеличьте концентрацию первичных антител.
  • Увеличьте время инкубации первичного антитела.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.

Слабый сигнал, слабый фон

  • Увеличьте концентрацию первичных антител и сократите время инкубации.
  • Дальнейшее блокирование окрашивания фона.
  • Увеличьте время инкубации вторичного антитела.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Слабый сигнал, сильный фон

  • Дальнейшее блокирование окрашивания фона.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, фона нет

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, слабый фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Увеличьте концентрацию первичных антител и время инкубации.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.

Сигнала нет, сильный фон

  • Следуйте общим подходам шаг за шагом.
  • Попробуйте различные методы поиска антигена.
  • Переключитесь на более чувствительную вторичную систему детекции.
  • Обратитесь за помощью в технический отдел основного поставщика антител.
  • Используйте другое первичное антитело.
Примечание

Ассоциация специалистов лабораторной гистотехнологии прилагает все усилия для предоставления точной и актуальной информации. Однако мы не даём гарантии относительно точности предоставленной информации (содержания и протоколов иммуногистохимического окрашивания), соответствующей последним достижениям в области иммуногистохимии на любой момент времени.

Авторы

Авторы и члены редакционного совета: Материал подготовлен экспертами Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии

Юнусов Теймур Юнусович

Юнусов Теймур Юнусович

Президент Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Шилов Александр Викторович

Шилов Александр Викторович

Врач-патологоанатом, руководитель службы контроля качества патологоанатомических исследований, член президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Полина Ксения Константиновна

Полина Ксения Константиновна

Руководитель отдела контроля качества патологоанатомических исследований, член правления Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Вишнякова Виктория Владимировна

Вишнякова Виктория Владимировна

Медицинский технолог службы контроля качества патологоанатомических исследований, член Президиума Ассоциации специалистов в области лабораторной гистотехнологии.

Литература

  1. Chang KL, Arber DA, Weiss LM. CD20: A review. Applied Immunohistochemistry. 1996; 4:1-15.
  2. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds.) WHO Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon, IARC Press 2001.
  3. Jilani I, O'Brien S, Manshuri T, Thomas DA, Thomazy VA, Imam M, Naeem S, Verstovsek S, Kantarjian H, Giles F, Keating M, Albitar M. Transient down-modulation of CD20 by rituximab in patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2003 Nov 15;102(10):3514-20.
  4. Khalidi HS, Brynes RK, Medeiros LJ, Chang KL, Slovak ML, Snyder DS, Arber DA. The immunophenotype of blast transformation of chronic myelogenous leukemia: a high frequency of mixed lineage phenotype in "lymphoid" blasts and a comparison of morphologic, immunophenotypic, and molecular findings. Mod Pathol. 1998 Dec;11(12):1211-21.
  5. Mohrmann RL, Arber DA. CD20-Positive peripheral T-cell lymphoma: report of a case after nodular sclerosis Hodgkin's disease and review of the literature. Mod Pathol. 2000 Nov;13(11):1244-52.
  6. Zukerberg LR, Collins AB, Ferry JA, Harris NL. Coexpression of CD15 and CD20 by Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease. Am J Pathol. 1991 Sep;139(3):475-83.
  7. nordiqc.org
  8. pathologyoutlines.com